限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease）也稱限制性酶（restriction enzyme），是由W. Arber，H. Smith和D. Nathans等人（1979年）從細(xì)菌中分離的一類(lèi)酶。限制酶具有極高的專一性，識(shí)別雙鏈DNA上特定的位點(diǎn)，將兩條鏈都切斷，形成粘末端或平末端。限制酶可以用來(lái)解剖纖細(xì)的DNA分子，在分析染色體結(jié)構(gòu)、制作DNA的限制酶譜、測(cè)定較長(zhǎng)的DNA序列、基因的分離、基因的體外重組等研究中是不可缺少的工具。對(duì)于研究DNA的分子生物學(xué)家來(lái)說(shuō)，這是一把天賜神刀——分子生物刀。
限制性酶的生物學(xué)功能在于防御或“限制”入侵細(xì)胞的外DNA（如噬菌體DNA）。原核生物利用他們獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶把外來(lái)DNA切成無(wú)感染性的片段。但不能降解自身細(xì)胞中的染色體DNA，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)還有“共座”的DNA甲基化酶修飾相應(yīng)序列使之受到保護(hù)。
限制酶可被分成三種類(lèi)型。I型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亞基有通過(guò)在特殊堿基上補(bǔ)加甲基基團(tuán)對(duì)DNA進(jìn)行化學(xué)修飾的活性。I型限制性內(nèi)切酶在隨機(jī)位點(diǎn)切割DNA；Ⅲ型限制酶識(shí)別雙鏈DNA的特異核苷酸序列，并在這個(gè)位點(diǎn)內(nèi)或附近切開(kāi)DNA雙鏈。
Ⅱ型限制性內(nèi)切酶已被廣泛應(yīng)用于DNA分子的克隆和序列分析，這是因?yàn)樗鼈兯釪NA不需要ATP，并且也不以甲基化或其他方式修飾DNA。最重要的是它們?cè)谒鼈兯R(shí)別的特殊核苷酸順序內(nèi)或附近切割DNA鏈。這些特殊序列常常含4個(gè)或6個(gè)核苷酸殘基，通常具回文結(jié)構(gòu)（palindromic structure），切割后形成粘末端（或平末端）。例如，大腸桿菌的一限制酶稱EcoR I，它識(shí)別下列六核苷酸順序：
5'……GAATTC……3'
3'……CTTAAC……5'
這種回文結(jié)構(gòu)的兩條鏈以5'→3'方向閱讀序列都是一樣的結(jié)構(gòu)，當(dāng)EcoR I遇到DNA的這種序列時(shí)，它會(huì)對(duì)這種DNA鏈進(jìn)行交錯(cuò)切割，產(chǎn)生突出的5'末端。
5'……G AATTC……3'
3'……CTTAA C……5'
有些限制酶，如Pst I，它識(shí)別序列5'-CTGCAG-3'，并在A與G之間切割DNA雙鏈產(chǎn)生3'突出粘性末端。還有些限制酶，如Bal I，DNA鏈產(chǎn)生具有平末端（blunt end）的DNA片段。
限制酶的命名較為特殊。以EcoR I為例加以說(shuō)明。第一個(gè)大寫(xiě)字母E為大腸桿菌E. coil的屬名的第一個(gè)字母，第二、三兩個(gè)小寫(xiě)字母co為它的種名的頭兩個(gè)字母。第四個(gè)字母用大寫(xiě)R，表示所用大腸桿菌的菌株。最后一個(gè)羅馬字表示從該細(xì)菌中分離出來(lái)的這一類(lèi)酶的編號(hào)。目前提純的限制酶已很多，常用的約有100多種，并且已轉(zhuǎn)化成為商品。大大節(jié)約了研究人員的時(shí)間。
