一、RAPD技術的原理
RAPD技術是由美國的Williams等人于1990年發明的。它是以聚合酶鏈反應技術(PCR技術)為基礎，利用人工合成的寡核苷酸為引物，以從組織中分離出來的基因組DNA為模板，通過基因放大器合成多態性DNA片段的一種方法。由于不同品種DNA序列存在著差異，其引物結合位點以及兩結合位點之間的距離都有差異，這樣經PCR擴增后就產生了DNA片段的多態性，從而形成了RAPD標記。RAPD標記具有以下特點：
⑴、標記數量多，因為RAPD分析所用引物的數量是無限的，所以它可以覆蓋基因組中所有的位點。
⑵、標記所需模板DNA量小，因此不受季節、組織、器官及發育時期的限制。
⑶、所用引物沒有物種限制，一套引物可以用于不同生物基因組分析。
⑷、分析方便、快速、無需克隆自卑、同位素標記、Southern轉移等復雜的操作。
⑸、標記是顯性的，因此不能區別生物個體是純合型還是雜合型。
目前，RAPD技術已廣泛用于基因定位，尋找特定基因的連鎖標記，物種識別，系統進
化，遺傳多樣性檢測，遺傳作圖和遺傳育種等眾多領域。
由于RAPD技術是以PCR技術為基礎的，因此為了更好的掌握RAPD技術，有必要先了解PCR技術。
1、 PCR技術的原理
多聚酶鏈式反應技術簡稱PCR技術，是近年發展起來的一種體外擴增特異DNA片段
的技術，此法操作簡單，可在短時間內獲得數百萬個特異序列的拷貝，因此PCR技術雖然問世時間僅數年，但它已迅速滲透到分子生物學的各個領域。在分子克隆、遺傳病的基因診斷、法醫學、考古學等方面得到了廣泛的應用。
PCR技術與細胞內發生的復制過程十分類似，為在模板DNA、引物（16bp以上，最好為20~24bp）和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。按照反應的特點可將其分為三步：①、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙連解開形成單鏈；②、退火：當溫度突然降低時由于模板分子結構較引物要復雜的多，而且反應體系中引物DNA量大大多于模板，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少；③、延伸：在DNA聚合酶和4種脫氧核苷三磷酸底物及Mg2 存在的條件下，由DNA聚合酶5’→ 3’的聚合酶活性催化以引物為起點的DNA鏈延伸反應。以上3步為一個循環，每一循環的產物均可作為下一個循環的模板，數小時之后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段將得到大量的復制，數量可達到2×106~7拷貝。
2、 RAPD的原理
RAPD技術通常是利用一系列（通常數百個）不同堿基順序隨機排列的寡聚核苷酸單鏈
（通常為10bp）為引物，對所研究基因組DNA進行PCR擴增。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但對于任一一對特定的引物（可相同也可不同），如它們同基因組DNA序列有其特定的結合位點，這些特定的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合PCR擴增反應的條件，即引物在模板的兩條鏈上有互補位置，且引物3’端相距在一定的長度范圍之內（200~2000bp），就可擴增出DNA片斷。因此如果基因組在這些區域發生DNA片斷插入、缺失或堿基突變就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化，而使PCR產物增加、缺失或發生分子量的改變。通過對擴增產物的檢測即可測出基因組DNA在這些區域的多態性，由于進行RAPD分析時可用引物數很大，雖然對每一對引物而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的，但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組，因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。兩個物種的個體之間，親緣關系越接近，其相應的PCR擴增帶型也就越相似，反之則差異也就越懸殊。
二、多態性DNA隨機放大的條件
大多在Williams等（1990）的基礎上變動。一般每一個樣品的最后混合液為25ul，其中
含25ul 10×的DNA聚合酶緩沖液（由Tris-HCl，KCl，MgCl2和明膠等配成），各占100umol/L的dATP、dGTP、dCTP和dTTP，0．2umol/L的引物，20~25ng的模板DNA和0．5單位酶量的DNA聚合酶，然后用蒸餾水將混合物加到25ul。
三、影響RAPD的因素
1、引物
引物的合成是隨機的，但要滿足以下兩個條件：G C的含量不低于40%，5’與3’端的堿
基順序非反方向對稱，否則就無法合成專一的少數幾條DNA片段。引物的長度以10bp為佳，引物太短（＜9bp）易從模板上脫落，聚合反應難以進行，引物太長，成本提高，合成多態性DNA片段的可能性降低。
引物的濃度通常是0．2umol/L，這一濃度足以完成40個循環的擴增反應，引物濃度過高可能導致錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的幾率，這兩者均可競爭酶、Dntp和引物。但如引物濃度不足，則PCR的效率極低，擴增產物的產量太低。
2、Taq DNA聚合酶：
酶在70℃~75℃時具有最高的活力，此溫度下每一個酶蛋白分子每秒可延伸約150個核苷酸，溫度升高（＞80℃）或降低（＜70℃）時，聚合酶延伸速度明顯下降。該酶具有良好的熱穩定性，95℃保溫2小時，活性未見明顯損失。
該酶具5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活力，但無3’→5’的外切酶活力，因此，如PCR反應中發生某些核苷酸的錯配，該酶沒有校正功能。
該酶為Mg2 依賴性酶，MgCl2濃度在2．0mmol/L時酶活力最高，Mg2 濃度偏高，酶活力受抑制。由于Mg2 能與負離子或負離子團（如磷酸根等）結合，在PCR反應中模板DNA、引物及dNTP均可與Mg2 結合，尤以dNTP的影響最大，所以MgCl2濃度在不同反應體系中應適當進行調整，一般反應中Mg2 濃度至少應比dNTP總濃度高出0．5~1．0mmol/L。
KCl的最適濃度是50mmol/L，高于75mmol/L時PCR反應明顯抑制，均衡的dNTP有利于酶活性的發揮，并能減少錯配和獲得多量的特異性DNA擴增產物。
在25ul反應體系中，聚合酶的用量為1~2U，根據擴增片斷的長度及復雜程度（G C含量）不同而有所區別，使用聚合酶濃度過高，可引起非特異產物的擴增，濃度過低，則合成的產物量減少。
3、底物（dNTPs）
dNTPs溶液應在-20℃存放，過多的凍融會使dNTPs降解。在RAPD反應中，dNTPs濃
度系在飽和濃度(200umol/L)下使用，dNTPs濃度過高可加快反應速度，同時還可增加堿基的錯誤摻入率和實驗成本，反之，低濃度的dNTPs會導致反應速度的下降，但可提高試驗的精確性。4種dNTPs在使用時必須以等當量濃度配制，以減少錯配誤差和提高使用效率，此外，由于dNTPs可能與Mg2 結合，因此，應注意Mg2 濃度和dNTPs濃度之間的關系。
4、反應的緩沖液
緩沖液成分：50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl （室溫下pH=8．4）
1．5mmol/L MgCl2
緩沖液中能影響反應的特異性和擴增片斷的產率，在一般的PCR反應中，1．5~2．0mmol/L是比較合適的（對應dNTP濃度為200umol/L左右），Mg2 過量能增加非特異擴增并影響產率。由于Mg2 的最佳作用濃度相當低，因此所制備的模板DNA中不應含有高濃度的鰲合劑，如EDTA，不應含有高濃度的帶負電荷的離子基團，如磷酸根。
緩沖液中的BSA和明膠對酶起保護作用。KCl在50mmol/L時能促進引物退火，大于此濃度時將會抑制TaqDNA聚合酶的活性。10~50mmol/L Tris-HCl，pH8．4，起調節pH使TaqDNA聚合酶的作用環境維持偏堿性。
5、RAPD的循環參數
PCR擴增是由變性、退火、（復性）和延伸三個步驟反復循環組成的。其中每一步的溫度、時間以及循環次數等參數是非常重要的。
⑴、變性
一般選擇94℃，30s~1min，可使各種復雜的DNA分子完全變性。應根據模板DNA的復雜程度，調整變性溫度和時間。對GC含量高的DNA，應用較高的變性溫度和時間。若變性不充分，會影響PCR產物的產量，反之若過度變性（溫度過高，時間過長）會對TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子造成損壞。RAPD反應由于用基因組DNA，因此變性時間稍長為1min。
⑵、退火
由于RAPD的引物短，因此退火溫度應比常規PCR溫度（50℃）低，為36℃，溫度過高會引起引物從模板上脫落。退火時間也比常規PCR(30s)長，為1min30s，以利于引物與模板DNA的牢固結合。
⑶、延伸
延伸溫度應選擇在70~75℃之間，此時，TaqDNA聚合酶具最高活力。RAPD反應由于引物過短，延伸溫度不利過高，否則不利于引物與模板的結合。RAPD中可采用使反應溫度緩慢升高到70~75℃的方法，因為在最初較低溫度下，DNA聚合酶已催化延伸反應開始（1．5個bp/s），接下來的較高溫度不會對這種延伸過的引物和DNA模板的結合發生影響。延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1分鐘延伸足以完成2kb的序列，擴增片段在2kb以上，則需加長延伸時間。RAPD反應由于擴增片段的長度是隨機的，有可能有2kb以上的片段，因此延伸時間比常規PCR(1min)長，為1min30s。
⑷、循環次數
RAPD一般為35~40個，循環次數的選擇主要取決于模板DNA的濃度，濃度高，則循環次數可降低，過高的循環次數（＞40次），則會增加非特異性產物的量及其復雜度。
5、模板
RAPD反應由于引物序列短，擴增片段隨機，因此為獲得理想的結果，除模板中不應含有高濃度的EDTA和鹽離子外，對模板的純度要求甚高，OD260/OD280最好在1．8，OD260/OD230 ＞2．0，工作濃度一般為50~100ng。
此外，如模板為環狀，則應先將其線狀化，因閉環DNA的擴增效率低。
