一、原位缺口翻譯檢測(cè)裂解的DNA片段

1．取106經(jīng)促調(diào)亡物質(zhì)處理的細(xì)胞，用1％ BSA-PBS洗滌細(xì)胞后加入0.1ml FITC標(biāo)記的抗CD4或抗CD8單克隆抗體，4℃ 20分鐘。用1％ BSA-PBS洗滌細(xì)胞。置冰上。

2．加入0.1ml 1％多聚甲醛，置冰上5分鐘，加入60％（v/v）甲醇溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，4℃固定細(xì)胞15分鐘。4℃離心500×g 10分鐘，去上清液。

3．加入0.1ml 0.1％ Triton X-100，4℃15分鐘。用1％ BSA-PBS洗滌細(xì)胞2次。加入50μl缺口翻譯緩沖液（50mmol/L Tris-HCl pH7.4，5mmol/L MgCl2, 1.5U大腸桿菌DNA多聚酶I，50nmol/L 生物素-14-dUTP，50nmol/L dATP, 50nmol/L dGTP, 50nmol/L dCTP），37℃反應(yīng)60分鐘。用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，懸浮于0.1ml預(yù)冷的1％ BSA-PBS中。

4．加入10μl抗生素蛋白-PE，4℃ 30分鐘，用冷PBS洗滌細(xì)胞。

5．上樣于FACS儀，用FACScan LysisⅡ軟件分析。可以同時(shí)了解調(diào)亡細(xì)胞的類型。

二、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)法檢測(cè)裂解的DNA片段

1．在37℃，含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，用促調(diào)亡物質(zhì)喜樹堿處理人PBMC 4小時(shí)。或用10－5g/ml地塞米松處理小鼠胸腺細(xì)胞4小時(shí)。

2．取106經(jīng)處理的細(xì)胞，用1％ BSA-PBS洗滌細(xì)胞后加入0.1ml FITC標(biāo)記的抗CD或抗CD8單克隆抗體，4℃ 20分鐘。用冷1％ BSA-PBS洗滌細(xì)胞2次。置冰上，加入0.1ml 1％多聚甲醛，4℃ 15分鐘。用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入冷70％（v/v）乙醇溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，－20℃固定細(xì)胞24小時(shí)。4℃離心500×g 10分鐘，去上清液。

3．用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入50μl TdT反應(yīng)液懸浮細(xì)胞，37℃反應(yīng)30分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞2次，懸浮于0.1ml PBS中。

4．加入10μl抗生物素蛋白-TC或抗生物素蛋白-FITC，室溫反應(yīng)30分鐘，用PBS洗滌細(xì)胞。

5．上樣于FACS儀，分析調(diào)亡細(xì)胞的類型和調(diào)亡情況。

三、7-AAD染色法

1．取5×105經(jīng)不同處理的細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞1次，加入10倍量PBS，離心500×g 5分鐘，去上清液。

2．用0.5ml含20μg/ml 7-ADD的PBS懸浮細(xì)胞，4℃避光放置20分鐘。

3．直接在FACS上用650nm濾光片檢測(cè)紅色熒光，用Lysis Ⅱ軟件分析，可區(qū)分活細(xì)胞（R1）、早期調(diào)亡的細(xì)胞（R2）和后期調(diào)亡細(xì)胞/死細(xì)胞（R3）。

四、PI染色法

1．取2.5×105～3.5×105經(jīng)不同處理的細(xì)胞，接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中，在37℃ 5％ CO2飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48小時(shí)。

2．每孔加50ml 100mg/ml PI。直接在FACS上用FL2濾光片檢測(cè)紅色熒光，用Lysis Ⅱ軟件分析，可區(qū)分活細(xì)胞（R1，不著染）和死細(xì)胞（R2，著染）。

五、Annexin V、7-AAD（或PI）聯(lián)合染色法

1．配制10倍濃縮的結(jié)合緩沖液：含140mmol/L NaCl, 25mmol/L CaCl2的0.1mol/L pH 7.0 Hepes/NaOH緩沖液，4℃保存，用前用雙蒸水稀釋10倍。

2．用預(yù)冷的PBS洗滌經(jīng)不同處理的待測(cè)細(xì)胞，洗2次。用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞配制1×106/ml。取0.1ml細(xì)胞懸液置5ml培養(yǎng)管中。

3． 
加入5μl AV-FITC，再加5μl 7-ADD或10μl PI。稍稍混懸細(xì)胞，置暗處，室溫（20～25℃）15分鐘。

4．立即加入0.4ml結(jié)合緩沖液，終止反應(yīng)。立即在FACS上分析。注意設(shè)立對(duì)照：未經(jīng)處理的細(xì)胞對(duì)照，排除自發(fā)調(diào)亡；不加染色劑的對(duì)照；只加AV的對(duì)照；只加7-ADD或PI的對(duì)照等。

六、溴乙啶/吖啶橙染色法

1．用細(xì)胞培養(yǎng)液將經(jīng)不同處理的細(xì)胞配成5×106/ml。向25μl細(xì)胞懸液中加1μl溴乙啶/吖啶橙染液。室溫中染色適當(dāng)時(shí)間。

2．在熒光顯微鏡的高倍鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞和有異常染色質(zhì)分布的細(xì)胞。吖啶橙著染經(jīng)理調(diào)亡的細(xì)胞核，溴乙啶染色死亡的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色。